MTT检测细胞增殖
1.1.细胞复苏
(1)从-80℃冰箱迅速取出冻存人结肠癌 SW480 细胞的冻存管，然后迅速投入37℃水浴箱中，轻轻摇动冻存管，使冻存管内容物迅速融化，取出后用 75%酒精消毒，放入无菌操作台，在操作台中开启冻存管。用 1000ul 的移液枪吸出溶解的细胞悬液，注入离心管，同时往离心管中加入 10 倍 10%灭活新生小牛血清RPMI-1640 培养基，准备离心。
(2) 室温下，1000 rpm，离心 5min，用移液枪吸取离心管中上清液、弃去，然后用细胞培养液洗 1～2 次，弃去上清培养液后，加入 1ml 培养液，用吹打管轻轻吹打，使离心管底部的细胞悬于培养基中，形成悬浮液。
(3)用培养液适当稀释悬浮液后，用移液枪将细胞悬液接种到 100ml 的无菌培养瓶，盖好瓶盖，将接种有人结肠癌 SW480 细胞的培养瓶放入饱和湿度、5%CO2、温度为 37℃培养箱中培养，24h 后更换培养液，放入培养箱中继续培养，观察细胞的生长状况，待细胞生长状态基本恢复正常后，取对数期细胞进行实验。
1.2.细胞传代
(1)在普通光学显微镜下观察观察细胞的生长状况，当细胞在培养瓶贴壁面生长融合达 70%～80%时，弃去培养液，然后用 PBS 液洗 1～2 遍。
(2) 用 0.25%胰酶细胞消化液，于室温或 37℃下消化铁壁细胞数分钟，边消化边在显微镜下观察细胞的形态变化，当 70%细胞的胞膜发生皱缩，细胞体积变小、细胞变圆时，往培养瓶中加入 10%灭活新生小牛血清的 RPMI-1640 培养基4～5ml，终止消化。
(3)用弯头吸管反复吸取瓶内培养液吹打培养瓶的细胞贴壁生长面，吹打时确保培养瓶底部各个部位都要吹打到，动作轻柔，幅度不要太大，使贴壁细胞脱落形成细胞悬液。
(4)按实验所需细胞浓度接种，分成 2～3 个培养瓶，置于饱和湿度、5%CO2、温度为 37℃培养箱中继续培养。
1.3.细胞收集
(1) 在室温或 37℃下，用 0.25%胰酶消化液消化贴壁细胞，制成细胞悬液。
(2)用移液枪将培养瓶中细胞悬液移入 10ml 离心管，常温下 1000rpm，离心5min，弃去上清液，再加入 5ml PBS 洗涤 2～3 次。
1.4.细胞计数
(1) 在室温或者 37℃下，用胰酶消化液消化贴壁细胞，制成细胞悬液。
(2)取盖玻片、计数载玻片各一块，先用 PBS 清洗干净，再用 75%酒精反复擦拭计数载玻片和盖玻片，然后风干，盖上盖玻片，用 10ul 移液枪吸取细胞悬液 5μl 由盖玻片一侧缓慢的滴入计数载玻片中，使载玻片和盖玻片之间均匀的充满细胞悬液体。
(3)在用 10×物镜显微镜下，观察计数载玻片上四角计数格内所含细胞的总数X。计数原则：细胞压中线时，数上不数下，数左不数右，细胞团块合计为一个细胞。
(4)将计数所得细胞总数代入公式，得出细胞密度＝X/4×104个/ml（细胞数/毫升原液）。
1.5.细胞冻存
(1)选择对数期生长的细胞冻存，用浓度为 0.25%胰蛋白酶消化液把培养瓶中的贴壁细胞消化下来，把已经消化好的细胞根据细胞传代的方法收集起来，同时细胞计算，之后将收集的细胞加到离心管，1000rpm，离心 5min，去上清液。
(2)往离心管中加入冻存液，将细胞密度调整为(5～10)×106个/ml。冻存液的配制：甘油、胎牛血清按体积比 1:9 的比例均匀混合。
(3) 将离心管中含有细胞的冻存液分装到冻存管，每个冻存管加 1～1.5ml含细胞液， 在 4℃冰箱中放置 30 分钟，转入-20℃的冰箱中放置 2h 后，再放入-80℃冰箱 24h，最后转入液氮罐中保存。
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