Transwell细胞侵袭实验方法
一、Transwell小室制备
1. 无基质胶Transwell小室制备
① 包被基底膜：
用50 mg/L Matrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 uL枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/mL，直接用枪吸了涂在膜上。
② 水化基底膜：
吸出培养板中残余液体，每孔加入50uL含10g/L BSA的无血清培养液，37 ℃，30min。或者在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/uL) 60~80 µL (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃ 30 min使Matrigel聚合成凝胶。
2. 有基质胶的Transwell小室制备
将小室放入培养板中，在上室加入300 µL预温的无血清培养基，室温下静置15~30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。
二、制备细胞悬液
① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12~24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
② 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1~2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1~10×105，不超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
三、接种细胞
① 取细胞悬液100－200 µL加入Transwell小室，不同公司、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 µL。
② 24孔板下室一般加入500 µL含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，请参考说明书。下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
③ 培养细胞：常规培养12~48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生是正常现象，可不予处理。培养一段时间后，膜下出现了大气泡，接种细胞后1~2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
四、结果统计
检测穿过的细胞数有两种方法：
1. 直接计数法
（1）“贴壁”细胞计数
这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。 通过给细胞染色，可在镜下计数细胞
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。推荐采用0.1%结晶紫染色。
③ 细胞计数：Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。
（2）“非贴壁”细胞计数
由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。可以收集下层培养液，用流式细胞仪计数细胞量，也可用细胞计数的方法直接在镜下计数， MTT可以用。
2. 间接计数法
间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。
（1）MTT法
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 24孔板中加入500 µL含0.5 mg/mL MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37 ℃ 4 h后取出。
③ 24孔板中加入500 µL DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10 min，使之充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。
（2）荧光试剂检测
这类方法一般是与Transwell小室一起出售的，其原理与MTT法类似，是用一种荧光染料染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值。
（3）结晶紫检测
原理与MTT法类似。但结晶紫染色还有个优点，就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。
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